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        技術支持

        核酸提取純化簡介

        更新時間??2022-03 閱讀 191

        核酸是生命最基本的物質之一,可分為DNA和RNA,廣泛存在于動物、植物細胞、微生物等所有生命體中。它不僅起著儲存和傳遞遺傳信息的作用,而且在蛋白質的生物合成中起著重要的作用,從而在生長、遺傳和變異等一系列重要的生命現象中起著決定性的作用。核酸提取包括DNA提取、RNA提取和質粒提取。核酸是遺傳信息的載體,是基因表達的物質基礎,也是分子生物學研究的主要對象。無論如何研究核酸的結構或功能,首先都需要提取核酸和純化。

        博科核酸提取儀

        博科核酸提取儀是通過使用匹配的核酸提取試劑,可以自動提取樣品核酸的儀器。博科核酸提取儀可分為兩類:一類是大型自動液體工作站;另一種是小型自動核酸提取器,利用包裝好的配套試劑自動完成提取純化流程。大型自動液體工作站由于設備成本高,運行成本高,適合一次提取數千個同類樣品,很少使用。而小型自動化儀表因其設備和運行費用低、操作方便而被廣泛使用。



        核酸提取純化方法

        自1869年發現核酸以來,許多研究者對核酸的提取方法進行了不懈的探索,改進了核酸的各種原料和試劑,十二烷基磺酸鈉、苯酚、尿素、胍鹽等各種試劑都被應用于核酸的提取實驗,這些試劑都用于/kloc。其中,傳統的提取方法主要有苯酚提取法、堿裂解法、CTAB提取法和EtBr-CsCl梯度離心法。這些傳統的提取方法可以從不同的組織樣本中分離出DNA和RNA,但這些技術包括沉淀、離心等操作步驟,需要大量的生物樣本,提取步驟復雜、費時費力,產率不高,難以實現自動化操作。此外,大多數傳統方法還需要有毒的化學試劑,這對操作者的健康有潛在的危害。因此,隨著分子生物學和高分子材料的發展,它們從液相體系中分離出來。


        固體載體吸附法:


        基于固體吸附質載體的新型核酸萃取方法主要有:旋轉離心柱萃取法、玻璃珠吸附法、硅膠基質法、陰離子交換法、納米磁珠萃取法。該方法的操作步驟可分為三部分:


        (1)使用溶胞產物促進細胞破裂并釋放核酸進入液相


        (2)利用載體對核酸的強親和力和吸附作用,釋放出的核酸特異性結合于特定載體,使其他雜質如蛋白質、多糖、脂質等仍游離于液相中,并隨著上清液的去除而被去除。


        (3)通過調節洗脫液的離子強度和pH值,將吸附在載體上的核酸洗脫下來,得到純化 post-核酸。


        其中,離心柱DNA提取試劑盒因其價格低廉,操作相對方便,在市場上被廣泛使用。然而,隨著DNA提取需求的不斷增加,離心柱DNA提取的缺點也日益突出。樣品需求量大,損耗大,對稀有樣品無能為力,成為離心柱法不可避免的缺點。同時,離心柱法提取DNA的過程需要反復離心,不便于高通量和自動化操作,不符合現代生物實驗的要求。為了滿足現代分子生物學高通量、高靈敏度和自動化操作的發展需要,磁珠提取DNA技術于20世紀90年代誕生。其原理是磁珠表面具有特定的活性基團,在特定條件下可以與核酸發生特異性可逆結合。同時,利用磁珠本身的磁響應能力,在外加磁場的作用下,磁珠可以很容易地發生移動和定向富集,從而實現核酸的分離。



        磁珠法核酸提取的優點


        磁珠DNA提取是納米技術和生物技術的完*結合,具有其他DNA提取方法無法比擬的優勢:


        1.樣品需求低:微量物質可稱為高濃度核酸;


        2.操作簡單快捷:整個操作過程基本分為五個步驟(裂解、合并、洗滌、干燥、洗脫),全程無需離心操作,大部分可在30~60分鐘內完成;


        3.質量穩定可靠:游離磁珠與核酸的結合量較大,特異性結合使得核酸純度較高,并且核酸的回收量可以通過控制磁珠表面基團來調節;


        4.全自動操作:核酸 extractor可實現自動化、高通量操作,一鍵可提取幾十個甚至上百個樣品;


        5.安全無毒無害:試劑不含苯酚、氯仿等有毒化學試劑,完全符合現代環保理念。


        磁珠法核酸提取注意事項


        生物磁珠提取核酸在國內還是一種比較新的核酸的提取方法。相對于傳統的異戊醇萃取法和離心柱試劑盒法,很多人對這種方法并不了解,在用磁珠純化核酸的過程中也存在一些誤區。


        1.誤區一:磁珠用的越多,提取效果越好。


        很多老師喜歡在提取效果不好的時候加大磁珠的量。他們認為如果加入更多的磁珠,可以吸收更多的核酸。不得不說,這種想法是不可取的。


        磁珠的主要特點是在外磁場的作用下,能以固態分散在液體中或與液體分離。在任何試劑體系中,磁珠與液體的比例都應該有一定的閾值。如果超過一定比例,過多的磁珠會因為不能均勻分散在液體中而失去分散特性,在洗滌過程中核酸磁珠與液體的接觸效率不能充分提高。過多的磁珠也會吸附更多的雜質,對除雜的效果影響很大。有時,過多的磁珠會吸附液體體系中起主要作用的蛋白酶、溶菌酶等功能成分,導致整個試劑盒效率低下。很多時候提取效果不好的時候,減少磁珠的用量是提高提取效果的*好方法。


        通常情況下,磁珠法試劑盒給出的參比磁珠量略過量,因此很少有需要增加磁珠量來提高吸附效率的情況。但是,如果確定由于磁珠量不足導致提取效果差,則可以通過在一定范圍內增加磁珠量來提高提取效果。


        提取常量樣品(植物組織、全血等)時。),通常用量為10ul/次;提取微量樣本(如血清游離DNA、口腔拭子等)時。),磁珠量15~20ul/次。如果需要超過這個使用量,需要和技術工程師溝通。


        2.誤區二:試劑用的越多,提取效果越好。


        破解效果差?添加更多的裂解溶液。洗滌效果不好?多加洗潔精。這是很多客戶在使用套件時的慣性思維。


        但是對于磁珠法來說,每增加一次液體的體積,就會減少更多磁珠的碰撞概率,減少磁珠的碰撞概率會導致吸附率的大幅下降。所以在很多情況下,雖然增加裂解液和洗滌液確實能起到增強裂解和洗滌的作用,但磁珠提取的核心是磁珠吸附效率核酸,磁珠的碰撞效率無法保證,所以單純增加試劑用量來提高提取效果不一定完全有效。


        對于博科核酸提取試劑盒,通常裂解液的量不應超過400微升/次,洗滌液的量不應超過500微升/次。如果真的需要擴增系統,磁珠和樣品的量也要相應增加,擴增不一定等于比例。


        3.誤區三:洗滌次數越多,萃取效果越好。


        當提取的核酸雜質過多時,用戶會考慮多洗幾次,以得到更純的核酸。增加洗滌次數確實有利于核酸的純化,但考慮到每次洗滌都會損失一定量的核酸并增加核酸裂解水解的可能性,一般來說,洗滌次數控制在2~4次為宜。



        4.誤區四:取樣越多,提取效果越好。


        當樣本不夠新鮮或者核酸本身含量很少時,核酸的提取效果往往不好,很多老師會通過多樣本的方式來增加核酸的提取量。


        但單純增加樣品量有時會引入過多雜質,超過裂解液的裂解能力,降低提取效率,所以不建議單純增加樣品量來增加提取量。


        如果由于樣本量不足,提取量確實太低,建議先預處理后富集或濃縮后再提取?;蛘咴黾悠平獾耐陚湫?,暴露更多核酸也是一個解決方案。


        5.誤區五:如果某一種磁珠是好的,那么它應該在所有實驗中都很好用。


        磁珠的種類很多,不同的粒徑、分散性、磁響應時間、包覆的基礎基質、外部修飾的官能團、包覆的密度、官能團的臂長都會導致磁珠的特性不同。


        所以不同的磁珠所適應的實驗和系統也是不同的。就像核酸 extraction同樣的試劑,配方不完全一樣,用于核酸 extraction的磁珠性質也不完全一致。


        有些磁珠在constant 核酸萃取中表現出更高的吸附效率,有些磁珠更適合micro 核酸萃取。有些磁珠適用于偏酸性系列試劑體系,有些磁珠適用于偏堿性系列試劑體系。有些磁珠磁響應好但沉降速度快,比較適合磁棒自動提取器。有些磁珠沉降速度慢,但磁響應時間長,更適合移液自動提取器。


        少數幾種磁珠可以用于所有實驗。大多數情況下,磁珠和試劑系統需要調整一定時間,固定試劑盒除外。


        6.誤區六:與某個套件相比,效果不好,就是磁珠不好。


        很多客戶在篩選磁珠的過程中,簡單的在成熟的試劑體系下等量更換磁珠,比較磁珠的效果。


        這樣就很容易得出某些磁珠效果不好的結論,但實際上由于不同的磁珠有不同的適用體系和用量,往往需要調整才能獲得更好的提取效果。



        博科核酸提取儀純化核心參數

        提取原理、機械原理、提取時間、樣品處理量、樣品管容量、吸頭處理量、吸頭數量、接口、儀器重量和儀器尺寸。


        博科核酸提取儀 純化應用領域

        幾乎在每一個實驗室中,與生物分子相關的分離純化工作都是非常重要和必不可少的。但是,在多個樣本上執行純化還是相當困難的。不僅需要選擇合適的純化技術,而且工作量極大,難以滿足當前高通量樣品提取純化的快速發展。博科BNP96磁珠提取純化系統采用磁珠法技術,可同時操作1-32個樣本,可廣泛應用于基因組學、疾病控制與醫療、食品安全、法醫鑒定等領域。


        1.基因組學


        博科BNP96磁珠提取純化系統非常適合基因組學研究。無論提取樣本的來源是微生物、動物、植物還是病毒,結合博科BNP96磁珠提取純化系統專門優化的天龍全血基因組DNA提取試劑盒、白細胞層全血基因組DNA提取試劑盒和動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒,都可以快速提取足夠數量和純度的DNA或RNA純化。高質量核酸可以滿足下游應用的需求(如PCR/實時PCR、基因芯片、Southern印跡、Northern印跡)。、


        2、疾病控制中心


        基于博科BNP96磁珠提取純化的快速高通量技術,可用于解決甲型H1N1流感病毒亞型、兒童手足口病、麻疹病毒等疾病快速自動化監測系統。,提高重大疫情的應對能力。天龍病毒DNA/RNA提取試劑盒可高效用于棉簽、血清等樣品的RNA提取,尤其適用于低拷貝復雜樣品。將原始病毒含量為7.5TCID50/100μl的腸道病毒EV-71株(FY04-R5-C1)用5個稀釋度稀釋10倍,分別用離心柱和天龍NP968磁珠純化 system提取100μl樣品。RNA提取后實時PCR檢測結果。(來源:中國疾病預防控制中心)


        3.臨床樣本的分子診斷


        博科BNP96磁珠提取純化系統可快速高通量處理臨床樣本,提取的核酸可用于后續分子診斷。博科BNP96結合天龍FFPE組織基因組DNA提取試劑盒也適用于福爾馬林固定和石蠟包埋的組織樣品。


        4.畜牧獸醫


        它能高效、靈敏地提取禽流感病毒、新城疫病毒、豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒、貝氏柯克斯體等。


        5.法醫學的應用


        對于法醫工作來說,核酸提取效率和穩定性非常重要。天龍NP968磁珠提取純化系統配合特殊法醫樣本核酸磁珠提取試劑使用,可從不同來源的材料中提取純化高質量DNA,包括煙蒂、發根、軟骨、指甲、血漬等。,*大吞吐量為32個樣本/次。



        核酸 extraction 純化常見問題

        Q1:在提取的質粒中加入緩沖液3后,增加離心速度和時間對提取的產物有什么影響?


        A1:加入緩沖液3后,增加新轉速和離心時間確實有利于沉淀更緊密的附著,但在常溫下。


        如果離心時間過長,液體溫度會升高,導致質粒降解。一般可以在4℃,12000rpm離心。


        10分鐘,或在常溫下以12000轉/分鐘離心3-4分鐘。


        Q2:回收瓊脂糖凝膠時,如果回收的DNA片段太短怎么辦?


        A2:如果回收的DNA片段小于500bp,為了提高回收效率,可以加入凝膠溶液溶解凝膠。


        之后,加入凝膠塊體積1.5倍的異丙醇,并完全倒置混合。


        Q3:回收瓊脂糖凝膠時,溶膠后凝膠溶液顏色異常如何處理?


        A3:凝膠溶液完全溶膠后,正常顏色應為淡黃色。若顏色變為紅色或橙色,需加入5μl 5M NaAc(pH5.2)調節溶液的pH值,使混合液顏色恢復正常的淺黃色(若不調節pH值,會影響DNA的回收率)。


        問題4:如何確定基因組DNA提取中裂解液體積和樣品質量的關系:


        A4:理論上,裂解液體積越大,樣品量越少,提取的產品質量越好。因此,應在實驗前探索和優化裂解物體積與樣品質量的*佳比例。以下僅為1ml裂解液可裂解樣品量的推薦值,僅供參考。


        Q5:提取基因組DNA時,可以采用哪些方法來提高產品產量?


        A5-1:適當增加裂解物體積與樣品質量的比值。


        A5-2:預先將洗脫液預熱至65℃左右。同時,上柱時要小心地將洗脫液加到吸附膜的中部,并保證液體完全覆蓋膜。


        A5-3:如果樣品裂解后的混合溶液體積太大,需要多次上柱,每次上樣量不得超過700μl。


        A5-4:適當延長組織的勻漿和裂解時間。


        Q6:為什么提取產品的A260/A280比值較高?


        A6:純DNA的A260/A280比值在1.8到2.0之間。如果樣品中有大量的RNA,A260/A280比值會更高,在提取過程中要加入RNase A(如果按照提取過程中的說明加入RNase A,要考慮RNase活性降低的可能性)。



        問題7:提取血液基因組DNA前樣品處理的注意事項?


        A7-1:人血中含有大量可能干擾下游DNA分析的酶抑制劑,其他常見的抗凝劑如干擾素、EDTA等也會干擾下游檢測。因此,在從人的血液中分離DNA時,需要有一種方法能夠提供高質量的DNA,并且不含污染物和酶抑制劑。


        A7-2:哺乳動物紅細胞不含核酸,但健康哺乳動物紅細胞含量比白細胞(包括淋巴細胞、單核細胞、顆粒白細胞等)高近1000倍。)含有核酸,所以在提取基因組DNA前去除紅細胞可以提高DNA產量。推薦的方法如下:


        A7-2-1:選擇性溶解紅細胞:在低滲緩沖液條件下,紅細胞會處于早期低滲休克狀態,迅速破裂。


        A7-2-2: Ficoll密度梯度離心可回收單核細胞(淋巴細胞和單核細胞),去除紅細胞(此法也可去除粒細胞)。


        a7-2-3:3300g全血室溫離心10min,然后分三層:上清液層為質粒;中間層是白細胞層;底層含有濃縮的紅細胞。


        A7-3:鳥類、魚類和青蛙的紅細胞中含有核酸,所以不需要對紅細胞進行處理。


        A7-4:血液樣本(包括去除紅細胞的血液樣本)可被裂解液和蛋白酶或蛋白酶k有效裂解


        A7-5:除了動物基因組DNA之外,也可以從血液中分離出病毒和細菌DNA。


        Q8:提取總RNA時,如何確定裂解液與樣品量的關系?


        答8:理論上,裂解液體積越大,樣品量越少,提取的產品質量越好。因此,應在實驗前探索和優化裂解物體積與樣品質量的*佳比例。以下僅為1ml裂解液可裂解樣品量的推薦值,僅供參考。


        問9:提取總RNA時如何處理樣品?


        A9-1:理論上,樣品越新鮮,總RNA質量越好。如果不能及時提取,樣品需要用液氮快速冷凍,然后一直保存在-80℃。樣品反復凍融對提取的RNA質量影響很大。


        A9-2:斷裂:完全破壞組織結構、細胞壁和質膜對于釋放樣品中的所有RNA是非常必要的。不同的樣品需要不同的方法才能達到徹底粉碎的效果。不完全片段化會導致RNA產量顯著下降。


        A9-3:勻漿:勻漿是破碎后降低細胞裂解液粘度所必需的。勻漿可以切斷高分子量基因組DNA和其他高分子量細胞成分,獲得均一的裂解產物。勻漿不完全會導致RNA結合效率下降,產量顯著降低。


        A9-4:不同樣品處理方法的建議


        Q10:RNA提取后如何定量?


        A10-1:檢測RNA樣品時,需要確保比色皿中已去除RNA酶,尤其是測定后仍需回收RNA時(操作方法可依次用0.1M NaOH、1mM EDTA、無RNA酶水清洗)。


        A10-2:使用紫外透明塑料比色皿的分光光度計,測量A260的吸光度時,讀數應在0.15-1.0之間。在A260波長下,一個單位的吸光度對應于44μg/ml的RNA濃度(這種相關性只對中性pH值條件下的檢測有效。因此,為了稀釋RNA樣品,應使用具有中性pH值如pH7.0的低鹽緩沖液和10mM Tris HCl。)


        A10-3:RNA定量的例子


        RNA樣品體積=100μl


        稀釋=10μl RNA樣品+490μl 10mM Tris HCl,pH7.0(稀釋比1:50)


        使用1ml RNase酶比色皿檢測稀釋樣品的吸光度。


        A260=0.2


        RNA濃度


        =44微克/毫升×260×稀釋倍數


        = 44微克/毫升× 0.2× 50


        =440微克/毫升